食品安全與動植物檢疫是保障公眾健康、維護生態(tài)安全的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。近年來，食品市場中“牛肉摻馬肉”“羊肉摻鴨肉”“名貴中藥材以偽代真”等物種摻假問題頻發(fā)，不僅損害消費者權(quán)益，還可能引發(fā)過敏、食源性疾病等風險；同時，外來物種入侵（如紅火蟻、假高粱）及疫病載體物種（如攜帶禽流感病毒的野禽）的快速識別，也對檢疫檢測的時效性與準確性提出更高要求。

傳統(tǒng)物種鑒定方法存在明顯局限：形態(tài)學鑒定依賴專業(yè)經(jīng)驗，無法識別破碎、加工后的樣本；普通PCR需電泳驗證，操作繁瑣且無法定量；進口熒光定量PCR儀則存在成本高、售后響應(yīng)慢等問題。博清生物科技（南京）有限公司作為國產(chǎn)儀器代表，其研發(fā)的熒光定量PCR儀具有高性價比、適配國產(chǎn)試劑、操作便捷等特點。本研究通過建立標準化檢測體系，系統(tǒng)驗證該儀器在物種鑒定中的性能，為其推廣應(yīng)用提供科研依據(jù)。

一、材料與方法

（一）實驗材料

1、樣本來源：實驗用牛肉、豬肉、羊肉、雞肉、三文魚、鱈魚、西洋參、人參等樣本均采自當?shù)剞r(nóng)貿(mào)市場；檢疫截留樣本（疑似攜帶外來物種卵的木材、進口凍品）由當?shù)睾ｊP(guān)提供。

2、試劑：動物基因組DNA提取試劑盒、植物基因組DNA提取試劑盒、2×TaqMan? Probe qPCR Mix、目標物種特異性引物與探針。

3、儀器：博清生物熒光定量PCR儀、超微量分光光度計、高速離心機。

（二）實驗方法

1、樣本前處理與DNA提取

肉類/水產(chǎn)品樣本：取50mg組織，經(jīng)液氮研磨后，用動物基因組DNA提取試劑盒提取總DNA，操作嚴格遵循試劑盒說明書。

中藥材樣本：取100mg粉末，用植物基因組DNA提取試劑盒去除多糖、多酚干擾，提取總DNA。

檢疫樣本：木材樣本刮取表面粉末，凍品樣本取100mg組織，按對應(yīng)試劑盒提取DNA。

用超微量分光光度計檢測DNA純度（A260/A280值1.8~2.0為合格）與濃度，并用無酶水稀釋至100ng/μL備用。

2、引物與探針設(shè)計

以物種保守基因序列為靶點，通過NCBI數(shù)據(jù)庫比對，設(shè)計特異性引物與TaqMan探針，確保僅對目標物種產(chǎn)生熒光信號，無交叉反應(yīng)。

3、qPCR反應(yīng)體系與程序

反應(yīng)體系（20μL）：2×TaqMan Probe qPCR Mix 10μL，上游引物（10μmol/L）0.8μL，下游引物（10μmol/L）0.8μL，探針（5μmol/L）0.4μL，DNA模板2μL，無酶水6μL?？瞻讓φ找詿o酶水替代模板，陰性對照以非目標物種DNA為模板。

反應(yīng)程序：預(yù)變性95℃ 30s；擴增階段40個循環(huán)（95℃ 5s，60℃ 30s，熒光信號采集于60℃階段）；溶解曲線分析（60℃→95℃，升溫速率0.1℃/s）。

4、儀器性能驗證

特異性驗證：以目標物種與非目標物種DNA為模板，檢測熒光信號，判斷是否存在交叉反應(yīng)（Ct值＞38或無擴增為陰性）。

靈敏度驗證：將目標物種標準質(zhì)粒（濃度10?~101copies/μL）梯度稀釋，檢測最低檢出濃度，分析Ct值與濃度的線性關(guān)系（R2≥0.99為合格）。

重復(fù)性驗證：對同一標準品進行3次平行實驗（批內(nèi)重復(fù)），連續(xù)3天檢測（批間重復(fù)），計算CV值（CV＜5%為合格）。

實際樣本檢測：對100份市場盲樣（宣稱“純牛肉丸”“進口三文魚”等）及50份檢疫截留樣本進行檢測，與對照設(shè)備熒光定量PCR儀的結(jié)果比對，計算準確率。

二、結(jié)果與分析

（一）特異性結(jié)果---

博清生物熒光定量PCR儀對目標物種（牛肉、三文魚、西洋參）均產(chǎn)生明顯熒光擴增曲線（Ct值22~28），非目標物種（豬肉、鱈魚、人參）及空白對照均無擴增（Ct值＞38），特異性達100%。表明該儀器可通過特異性引物-探針體系，精準區(qū)分目標物種與干擾物種，避免假陽性。

（二）靈敏度結(jié)果

目標物種標準質(zhì)粒濃度在101~10?copies/μL范圍內(nèi)，Ct值與濃度呈良好線性關(guān)系（R2=0.998~0.999），最低檢測限為101copies/μL。該靈敏度可滿足微量摻假檢測需求（如牛肉中摻5%以下馬肉）及檢疫中低濃度樣本（如昆蟲卵、微量組織）的識別。

（三）重復(fù)性結(jié)果

批內(nèi)重復(fù)實驗中，各濃度標準品的CV值為0.8%~1.5%；批間重復(fù)實驗中，CV值為1.2%~1.8%，均小于2%。表明博清生物儀器的檢測穩(wěn)定性優(yōu)異，數(shù)據(jù)可靠性高，可滿足實驗室常規(guī)檢測的重復(fù)性要求。

（四）實際樣本檢測結(jié)果

100份市場盲樣中，博清生物儀器檢出8份摻假樣本（如“牛肉丸”摻豬肉、“西洋參”摻人參），與進口儀器檢測結(jié)果完全一致，準確率100%；50份檢疫截留樣本中，檢出3份攜帶外來物種（如木材中檢出天牛卵DNA），準確率96%（2份因樣本DNA降解導致假陰性，進口儀器同樣未檢出）。整體實際樣本檢測準確率達98%，且單輪反應(yīng)耗時1.5小時，較傳統(tǒng)PCR（3~4小時）效率提升50%以上。

三、討論

本研究證實，博清生物熒光定量PCR儀在物種鑒定中具備“三高一快”優(yōu)勢：

（一）高特異性：基于保守基因的引物-探針設(shè)計，結(jié)合儀器精準的溫度控制（溫控精度±0.3℃），有效避免交叉反應(yīng)，解決了“近緣物種難區(qū)分”的問題（如牛肉與馬肉、西洋參與人參）。

（二）高靈敏度與重復(fù)性：最低檢測限達101copies/μL，可檢測微量摻假或低濃度檢疫樣本；CV值＜2% 的穩(wěn)定性，確保不同批次、不同操作人員的檢測數(shù)據(jù)一致，符合實驗室質(zhì)量控制要求。

（三）高效率：1.5小時完成單輪檢測，且儀器支持96孔板同時運行，可滿足批量樣本篩查需求（如食品企業(yè)原料驗收、海關(guān)集中檢疫），較傳統(tǒng)方法大幅縮短檢測周期。

與進口儀器相比，博清生物儀器還具有明顯的成本優(yōu)勢：儀器采購成本降低40%~50%，適配國產(chǎn)試劑（價格僅為進口試劑的1/3），且售后響應(yīng)時間＜24小時，更適合基層實驗室及中小企業(yè)推廣應(yīng)用。

本研究仍存在局限：目前僅驗證了12種常見物種的檢測體系，未來需擴展更多物種（如珍稀動物、外來入侵植物）的引物-探針庫；針對高脂肪、高色素樣本（如動物內(nèi)臟、深色中藥材）的DNA提取干擾，需進一步優(yōu)化前處理方法。后續(xù)可結(jié)合多重qPCR技術(shù)，實現(xiàn)“一次反應(yīng)檢測多種物種”，進一步提升檢測效率。

博清生物科技（南京）有限公司研發(fā)的熒光定量PCR儀在食品安全物種摻假檢測與動植物檢疫物種鑒定中，表現(xiàn)出高特異性、高靈敏度、高重復(fù)性與高效率的綜合性能，且成本可控、操作便捷。該儀器可作為國產(chǎn)替代方案，廣泛應(yīng)用于食品生產(chǎn)企業(yè)、市場監(jiān)管部門、海關(guān)檢疫機構(gòu)等場景，為保障食品安全與生態(tài)安全提供有力的技術(shù)支持。